SOD的稳定性研究

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当受到各种外部物理和化学因素的影响时,SOD还会发生自由基解聚,变性或其他结构变化(例如正常的酶蛋白分子)。 当然,伴随的结构变化不可避免地导致酶活性的降低或丧失。酶的失活,引起失活的因素及其机理在催化功能部分中有详细说明。 这里的讨论集中在一般蛋白质结构的稳定性上。
导致结构损坏的主要因素包括(1)化学试剂,例如变性剂和还原剂;(2)极端温度;(3)pH的变化;以及(4)其他外部物理和化学因素,例如电离辐射的影响会的。SOD,尤其是牛红细胞,与一般酶相比,在承受上述种种变性因素的供给方面表现出异常的稳定性,这种稳定性主要来源于金属辅基的存在。在远紫外区域的CD光谱和核磁共振研究中,在中性pH条件下,受到变性因素的影响,牛红细胞中的Cu,Zn-SOD和脱金属的互补酶蛋白是相同的。 前者是稳定的,而后者则是不稳定的。 Fe-和Mn-SOD也会发生这种情况。 以下比较了几种变性因子对天然酶与去除金属修复基团和金属修复基团的酶蛋白的影响。
变性剂和还原剂
牛红细胞Cu,Zn-SOD在含有SDS、EDTA的6 mol/L尿素中加热可引起解聚,但是单独用8 mol/L尿素并不能引起酶的解聚。沉降平衡分析发现,在8 mol/L尿素中,牛Cu,Zn-SOD仍然只出现单一的带,相对分子质量为32000±1200;10 mol/L尿素也不能使酶丧失活性。Bannister和Marmocci等报道8 mol/L尿素可引起剑鱼肝和牛红细胞、酵母及麦胚的Cu,Zn-SOD发生解聚。但是这些结果基于凝胶排阻层析(即凝胶过滤)技术,在实验过程中作为相对分子质量标准的蛋白质本身也会发生变性,所以对是否确实引起了解聚存有不同看法。Bannister本人也对此有保留意见。有不少实验证据表明,8 mol/L尿素虽然不引起蛋白质的解聚,却对酵母Cu,Zn-SOD的光谱性质有影响,从EPR图谱形状的改变说明尿素可引起蛋白质局部构象的变化。但是从总的印象看来,单单尿素并不能引起Cu,Zn-SOD发生大的改变,对牛红细胞Cu,Zn-SOD尤其是如此。该酶的远紫外区CD图谱表明,天然酶和去金属辅基的酶蛋白之间基本构象没有差别,在8 mol/L尿素作用下,天然酶的CD图谱中210 nm附近没有大的改变,但是酶蛋白的CD图谱却发生显著变化。从嗜热菌中提取的Mn-SOD在含有10 mmol/L EDTA的8 mol/L尿素中,pH中性条件下仍然很稳定,但是去除Mn后的酶蛋白就很不稳定。这些都说明金属辅基对蛋白质结构的稳定作用。SDS往往可引起Cu,Zn-SOD相对分子质量发生变化,但在1%~4%SDS的范围内,只引起酵母、细菌和麦胚Ⅰ型的Cu,Zn-SOD以及Mn-SOD发生解聚,对牛、人和麦胚Ⅱ型Cu,Zn-SOD并无影响。去除铜和锌的酶蛋白在SDS的作用下趋于解聚。 Marmocci等人使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳比较了几种衍生形式的牛红细胞Cu和Zn-SOD的解聚行为,一个简单的解聚顺序为E2E2-SOD> E2Zn2-SOD,或者我发现E2Co2-SOD> Cu 。 ,Zn-SOD是一种既去除Cu和Zn的酶蛋白(E2E2-SOD),又比仅去除Cu的酶蛋白(E2Zn2-SOD)或用Co替代Zn的酶蛋白(E2Co2-SOD)。非常好 解聚很容易,后两种比天然酶(Cu2Zn2-SOD)更容易解聚。
还原剂和2-巯基乙醇主要作用于-SH或二硫键。 X射线晶体学表明,牛红细胞的Cu,Zn-SOD肽链的二硫键位于亚基相互作用的接触表面,因此二硫键的完整性在亚基缔合中起着重要作用。2-巯基乙醇的添加可以促进人,牛和小麦胚芽中铜和锌超氧化物歧化酶的解聚。 在人类红细胞中,Cu和Zn-SOD的111位处存在半胱氨酸(C),而不是在牛酶的相应位置处存在丝氨酸(S),从而使酶的稳定性大大下降。用不同的提取方法或过程会发生各种转变状态的产物,而对C进行烷基化后,明显稳定了蛋白质并容易形成结晶。Fe-SOD的重组研究表明,在天然酶中有4个—SH基都包埋在酶分子内部或与Fe配位,但是当金属Fe被除去后,这4个—SH基就暴露出来,很快地与5,5'-二硫代双-2-消极苯甲酸反应,这无疑与除去金属引起的蛋白质分子构型改变有关。
SOD的热稳定性
天然牛红细胞Cu,Zn-SOD在0.01 mol/L pH为7.8的磷酸钾缓冲液中,75℃加热7 min,其可见光、紫外光吸收光谱和电子自旋共振波谱性质不发生改变,酶活性也不下降。构象熔点温度(Tm)的测量表明,牛红细胞Cu和Zn-SOD的Tm为83℃。 它是有史以来确定的最高的热稳定球蛋白之一,包括提取的蛋白质。 嗜热细菌。处于还原状态的酵母Cu,Zn-SOD在75℃下的NMR图谱与在40℃下的没有差别。表明在75℃下不仅蛋白质能够抵抗不可逆的变性作用,而且在40℃到75℃之间,蛋白质的主要构象特征也没有发生改变。上述异常高的热稳定性归功于金属辅基的存在。1973年Forman和Fridovich报道了金属离子对牛红细胞Cu,Zn-SOD热失活的影响。去金属辅基的Apo-SOD在49.4℃下加热10 min就有50%失活。以失活速度对温度作图表明,当高于或低于40.5℃时,反应活化能有很大差别,所以40.5℃可能就是对应于去金属辅基的Apo-SOD发生相变或构型改变的一个临界点。这与天然酶的构象融点温度(83℃)相差一倍多。各种金属离子对Apo-SOD的热稳定性的影响见表4-15。
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Mn-SOD和Fe-SOD的热稳定性取决于来源。 例如,从大鼠肝脏获得的Mn-SOD不耐热,但是将从人肝脏或鸡肝中提取的Mn-SOD在65°C至70°C加热几分钟,几乎没有酶活性损失。 -从硬脂芽胞杆菌获得的SOD在75°C加热时不会失去其活性,而从更耐热的水生嗜热菌(T.aquaticus)中得到的四聚体的Mn-SOD,在有50 mmol/L Tris、5 mmol/L EDTA存在的条件下密封加热到95℃没有明显的活性下降。这种耐热性,一方面与金属辅基存在有关,同时与这些酶不含半胱氨酸(C)残基有关。
本文摘自:《超氧化物歧化酶》——普通高等教育十三五规划教材 袁勤生